روش‌های نگهداری باکتری و قارچ+مراحل

 حفظ زیستی (Biopreservation)

حفظ زیستی فرآیندی است که سلامت و کارایی سلول‌ها را حفظ می‌کند. بسیاری از آزمایشگاه‌های باکتری‌شناسی کشت‌های میکروارگانیسم‌ها را برای اهداف آموزشی، تحقیقاتی، زیست‌سنجی و صنعتی نگهداری می‌کنند. با وجود طیف گسترده‌ای از تکنیک‌های موجود برای حفظ باکتری‌ها، انتخاب روش مناسب برای هر سویه خاص، به گونه‌ای که بقای آن را تضمین کرده و ژنوتیپ و ویژگی‌های منحصر به فرد آن را تغییر ندهد، می‌تواند چالش‌برانگیز باشد.

هدف اصلی حفظ کشت

هدف اصلی حفظ کشت‌های میکروبی، زنده نگه داشتن ارگانیسم‌ها بدون آلوده شدن و بدون تغییر یا جهش است. این فرآیند باید به گونه‌ای انجام شود که شرایط کشت تا حد ممکن نزدیک به ایزوله اولیه باقی بماند.

روش‌های نگهداری میکروارگانیسم‌ها

 

آگار کشت‌های شیب‌دار

در بیشتر آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی، میکروارگانیسم‌ها در آگارهای شیب‌دار نگهداری می‌شوند. این آگارها تلقیح شده و تا زمان ظاهر شدن رشد خوب انکوبه می‌شوند. سپس با یک لایه روغن معدنی استریل تا عمق یک سانتی‌متر بالاتر از سطح شیب‌دار پوشانده می‌شوند. کشت‌های شیب‌دار پس از انکوباسیون به مدت 24 ساعت یا بیشتر، در یخچال نگهداری می‌شوند. این کشت‌ها به صورت دوره‌ای به محیط‌های تازه منتقل می‌شوند. انتقال با برداشتن یک لوپ پر از کشت رشد کرده، تخلیه روغن اضافی و تلقیح محیط تازه انجام می‌شود. فواصل انتقال با توجه به منشاء و شرایط رشد متفاوت است. این روش ساده و مقرون‌به‌صرفه است و میکروارگانیسم‌ها را می‌توان به مدت چندین سال در دمای اتاق زنده نگه داشت.

 

نگهداری در یخچال

کشت‌های خالص را می‌توان با موفقیت در دمای 0 تا 4 درجه سانتی‌گراد در یخچال یا اتاق‌های سرد نگهداری کرد. این روش برای مدت کوتاهی (2 تا 3 هفته برای باکتری‌ها و 3 تا 4 ماه برای قارچ‌ها) مؤثر است، زیرا فعالیت‌های متابولیکی میکروارگانیسم‌ها کند می‌شود اما متوقف نمی‌گردد. بنابراین رشد آن‌ها به کندی ادامه می‌یابد، مواد مغذی مصرف می‌شود و مواد زائد در محیط آزاد می‌شود که در نهایت منجر به مرگ میکروب‌ها می‌شود.

 

 

روش پارافین (Paraffin)

روش پارافین یکی از ساده‌ترین و مقرون‌به‌صرفه‌ترین روش‌های نگهداری کشت خالص باکتری‌ها و قارچ‌ها است. در این روش، پارافین مایع استریل بر روی سطح شیب‌دار کشت ریخته شده و به صورت عمودی در دمای اتاق نگهداری می‌شود. لایه پارافین شرایط بی‌هوازی را فراهم کرده و از کم‌آب شدن محیط جلوگیری می‌کند. این شرایط به میکروارگانیسم‌ها کمک می‌کند تا در حالت خفته باقی بمانند و کشت برای چندین سال حفظ شود.

 

سوسپانسیون نمکی

کلرید سدیم در غلظت‌های بالا به‌عنوان یک مهارکننده رشد باکتری‌ها عمل می‌کند. در این روش، باکتری‌ها در محلول نمک 1% (غلظت غیرکشنده) در لوله‌های درپوش‌دار برای جلوگیری از تبخیر معلق می‌شوند. این لوله‌ها در دمای اتاق نگهداری می‌شوند و هر زمان که نیاز باشد، انتقال از روی سطح شیب‌دار آگار انجام می‌گیرد.

 

سرماداری (Cryopreservation)

سرماداری با استفاده از نیتروژن مایع در دمای 196- درجه سانتی‌گراد، به بقای طولانی‌مدت کشت‌های خالص کمک می‌کند. در این روش، میکروارگانیسم‌ها به سرعت در حضور عوامل تثبیت‌کننده‌ای مانند گلیسرول (Glycerol) که از تشکیل کریستال‌های یخ جلوگیری کرده و بقای سلول را تقویت می‌کند، منجمد می‌شوند. این روش امکان نگهداری کشت‌ها را برای مدت طولانی فراهم می‌کند.

 

لیوفیلیزاسیون (Lyophilisation) (انجماد-خشک کردن)

در روش لیوفیلیزاسیون، کشت به سرعت در دمای بسیار پایین (حدود 70- درجه سانتی‌گراد) منجمد شده و سپس با قرار دادن در محیط خلاء، بی‌آب می‌شود. تحت این شرایط سلول‌های میکروبی بی‌آب شده و فعالیت‌های متابولیکی آن‌ها متوقف می‌شود. در نتیجه، میکروب‌ها به حالت خفته رفته و می‌توانند سال‌ها زنده بمانند. کشت‌های خالص لیوفیلیزه شده سپس در تاریکی و در دمای 4 درجه سانتی‌گراد در یخچال نگهداری می‌شوند. این روش رایج‌ترین روش مورد استفاده در مراکز جمع‌آوری کشت است.

فرآیند لیوفیلیزاسیون (Lyophilisation)

 

لیوفیلیزاسیون یک روش مؤثر برای نگهداری کشت‌های میکروبی است. در این فرآیند، سوسپانسیون میکروبی در ویال‌های کوچک قرار می‌گیرد و با چرخاندن ویال‌ها در مخلوطی از یخ خشک (دی‌اکسید کربن جامد) و الکل یا استون در دمای 78- درجه سانتی‌گراد، لایه‌ای نازک از سوسپانسیون بر روی سطح داخلی ویال منجمد می‌شود.

مراحل لیوفیلیزاسیون

 

1. انجماد سوسپانسیون: ویال‌ها با چرخاندن در مخلوط یخ خشک و الکل یا استون منجمد می‌شوند.
2. خشک کردن در خلاء: ویال‌های منجمد بلافاصله به یک خط خلاء بالا منتقل می‌شوند. در این مرحله، ارگانیسم‌ها در حالی که هنوز یخ‌زده هستند، خشک می‌شوند.
3. مهر و موم کردن: آمپول‌ها در شرایط خلاء با شعله کوچک مهر و موم می‌شوند.

 

این کشت‌های لیوفیلیزه شده می‌توانند برای چندین سال در دمای 40 درجه سانتی‌گراد نگهداری شوند. این روش برای نگهداری سموم، سرم‌ها، آنزیم‌ها و سایر مواد بیولوژیکی نیز استفاده می‌شود.

احیای کشت‌های لیوفیلیزه شده

 

برای احیای کشت‌های میکروبی، کافی است ویال را به‌صورت آسپتیک باز کنید، یک محیط کشت مناسب اضافه کرده و پس از انکوباسیون، انتقال‌های بیشتری انجام دهید. این فرآیند امکان نگهداری تعداد زیادی از کشت‌ها را بدون تغییر در ویژگی‌های آن‌ها فراهم می‌کند و خطر آلودگی را به‌طور قابل توجهی کاهش می‌دهد.

نگهداری در دمای بسیار پایین

 

در این روش، ارگانیسم‌ها در نوترینت براث (Nutrient Broth) حاوی 15 درصد گلیسرول قرار داده می‌شوند. سوسپانسیون منجمد شده و در دمای 15- تا 30- درجه سانتی‌گراد نگهداری می‌شود.

 

نگهداری با خشک کردن در خلاء

 

در این روش ارگانیسم‌ها روی کلرید کلسیم در خلاء خشک شده و در یخچال نگهداری می‌شوند.

 

با راشا زیست همراه باشید…