سنجش سمیت با استفاده از روش MTT
روش MTT، یک تکنیک بسیار موثر و اولیه برای اندازه‌گیری زنده‌مانی سلول‌ها در پاسخ به سمیت داروها است و در سیستم‌های IN-VITRO به کار می‌رود. این روش در ابتدا به منظور بررسی سمیت داروهای ضد سرطان توسعه یافت، اما بعدها محققان متوجه شدند که می‌توانند از این روش برای ارزیابی افزایش رشد سلولی و همچنین اثبات عدم سمیت تمامی موادی که با انسان در ارتباط هستند، بهره ببرند و نتایج آن را به سیستم‌های IN-VIVO گسترش دهند.
یکی از کاربردهای این تست، استفاده آن برای اثبات عدم سمیت داربست‌های زیستی است که در بدن موجودات زنده ایمپلنت می‌شوند.
مکانیسم عمل روش MTT
ترکیب MTT یا دی‌متیل تیازول دی‌فنیل تترازولیوم بروماید، به عنوان یک مولکول بزرگ، به صورت گسترده در مطالعات زنده‌مانی سلول‌های تحت کشت مورد استفاده قرار می‌گیرد. این ترکیب، با داشتن یک حلقه تترازولیوم و حضور یون بروم، وارد سلول‌ها می‌شود و به آنها نفوذ کرده و متابولیزه می‌شود.
آنزیم‌های ردوکتاز داخل سلول، با استفاده از NADH که از متابولیسم تولید می‌شود، ترکیب MTT را تبدیل به یک پروتئین می‌کنند. این امر باعث شکستن حلقه تترازولیوم و تبدیل آن به یک ماده خطی به نام فورمازان می‌شود.
فورمازان به صورت حلال، قابلیت جذب نور در طول موج‌های 510 و 570 نانومتر را دارد و جذب نور بالا نشان دهنده کاهش ترکیب MTT است. این کاهش نشان دهنده افزایش سطح NADH داخلی سلولی است و نشان می‌دهد که تعداد بیشتری از سلول‌ها زنده هستند.
سمیت‌سنجی اختصاصی داربست ها
کاربردهای تکنیک سمیت‌سنجی به روش MTT
در ابتدا، با کشف ترکیب MTT، این ترکیب به طور اصلی برای ارزیابی تأثیر داروهای ضد سرطان بر سلول‌های سرطانی مورد استفاده قرار گرفت. همانطور که مشخص است، در جنگ با سلول‌های سرطانی، رویکرد اصلی کشتن آنها به روش آپوپتوز (مرگ برنامه‌ریزی شده) است.
اما بعدها، این تکنیک به تدریج برای ارزیابی داروهای دیگر نیز به کار گرفته شد. به عبارت دیگر، امروزه هر ترکیب یا محصول جدیدی که ساخته می‌شود و هدف از آن ارتباط مستقیم با انسان است، حتی اگر ربطی به سرطان نداشته باشد، با استفاده از روش‌های سمیت‌سنجی از جمله روش MTT، سمیت آن ترکیب بر سلول‌های مختلف انسانی و حیوانی بررسی می‌شود.
داربست‌های تولید شده برای مهندسی بافت نیز از این قاعده مستثنی نیستند. بنابراین، تمامی داربست‌ها نیز با استفاده از روش سمیت‌سنجی داربست‌ها مورد بررسی قرار می‌گیرند. در روش سمیت‌سنجی داربست، داربست مورد نظر به صورت مستقیم و یا غیرمستقیم در معرض سلول‌ها قرار می‌گیرد و سمیت آن مورد ارزیابی قرار می‌گیرد.
سمیت‌سنجی اختصاصی داربست ها
سمیت‌سنجی داربست‌ها به روش MTT
سمیت‌سنجی داربست‌ها به روش MTT در دو روش مستقیم و غیرمستقیم انجام می‌شود. در روش مستقیم، سمیت‌سنجی داربست به صورت مستقیم در معرض سلول‌ها قرار می‌گیرد و سپس زنده‌مانی سلولی مورد ارزیابی قرار می‌گیرد. در روش غیرمستقیم، سمیت‌سنجی داربست در مجاورت محیط کشت قرار می‌گیرد و سپس این محیط کشت به سلول‌های کاشته شده اضافه می‌شود.
در روش مستقیم، داربست‌های مورد نظر ابتدا به‌خوبی استریل شده و در کف پلیت قرار می‌گیرند. در این روش، هرچقدر داربست‌ها کوچک‌تر طراحی شوند، تست دقیق‌تر انجام می‌شود. چرا که این تست در پلیت‌های مختلف از 6 تا 96 خانه قابل انجام است و با استفاده از ابعاد کوچک‌تر چاهک‌ها، خطای کمتری دارد.
در روش سمیت‌سنجی مستقیم، باید توجه داشت که اگر داربست خود به تنهایی خاصیت احیاء کنندگی داشته باشد، ممکن است بر روی MTT تأثیر گذاشته و تولید فورمازان کاذب شود. این تست به‌صورت استاندارد در 5 تکرار و در روزهای 1، 3 و 5 انجام می‌شود. در روش سمیت‌سنجی داربست به روش مستقیم، دو سری چاهک با 5 تکرار با عناوین CONTROL و BLANK کاشته می‌شوند.
چاهک‌های کنترل شامل چاهک‌هایی هستند که محیط کشت کامل به‌همراه سلول‌ها را دریافت کرده و هیچ تیماری روی آنها انجام نمی‌شود. همچنین، چاهک‌های بلنک فقط محیط کشت بدون سلول را دریافت کرده و هیچ تیماری روی آنها انجام نمی‌شود.
سمیت‌سنجی اختصاصی داربست ها
تست MTT روی داربست‌ها
در روش غیرمستقیم سمیت‌سنجی داربست، سلول‌ها در یک پلیت 96 خانه کاشته شده و مجزا در ظرف استریل دیگری که هیچ سمیتی ندارد، از داربست‌ها عصاره گرفته می‌شود. به عبارت دیگر، همزمان با کاشت سلول‌ها در پلیت 96 خانه به شکل 5 تکرار به ازای هر داربست، داربست‌ها در همان روز در محیط کشت کامل قرار گرفته و به مدت 24 ساعت در انکوباتور کشت سلولی انکوبه می‌شوند.
مقدار داربست مورد استفاده در عصاره‌گیری سمیت‌سنجی داربست‌ها، بین 5 تا 100 میلی‌گرم به ازای هر 1 میلی‌لیتر محیط کشت متغیر است. تصمیم گیری برای مقدار داربست قرار داده شده در محیط کشت برای سمیت‌سنجی داربست، بستگی به نوع و ساختار آن دارد. به‌طور کلی، داربست‌های طبیعی آسلولار شده در مقدار 100 میلی‌گرم برای هر 1 میلی‌لیتر محیط کشت مدنظر قرار می‌گیرند.
در روش سمیت‌سنجی داربست به روش غیرمستقیم، دو سری چاهک با 5 تکرار با عناوین CONTROL و BLANK کاشته می‌شوند. چاهک‌های کنترل شامل چاهک‌هایی هستند که محیط کشت کامل به همراه سلول‌ها را دریافت کرده و هیچ تیماری روی آنها انجام نمی‌شود. همچنین چاهک‌های بلنک فقط محیط کشت بدون سلول را دریافت کرده و هیچ تیماری روی آنها انجام نمی‌شود.
علاوه بر این، در روش سمیت‌سنجی داربست‌ها به روش غیرمستقیم، دو سری چاهک با 5 تکرار با عناوین کنترل مثبت و کنترل منفی در نظر گرفته می‌شوند. کنترل مثبت شامل چاهک‌هایی هستند که محیط کشت به همراه سلول را دریافت کرده و با عصاره کشنده مانند عصاره لاتکس یا گرانول‌های صنعتی تیمار می‌شوند. کنترل منفی نیز شامل چاهک‌هایی هستند که محیط کشت به همراه سلول را دریافت کرده و با عصاره غیرسمی مانند عصاره فلاسک کشت سلولی یا گرانول‌های پزشکی تیمار می‌شوند.
با راشا زیست همراه باشید…
