فلاسک کشت سلول یکی از ابزارهای اساسی در آزمایشگاه‌های زیست‌شناسی است که برای فراهم کردن محیطی مناسب جهت رشد انواع سلول‌های پروکاریوت و یوکاریوت به کار می‌رود. این فلاسک‌ها معمولاً از شیشه یا پلیمرهای خنثی مانند پلی‌استیرن ساخته می‌شوند تا از آلودگی سلول‌ها جلوگیری کنند. کشت سلولی، یکی از مراحل مهم در پژوهش‌های زیستی است و برای بررسی آنزیم‌ها، اسیدهای نوکلئوئیک، آنتی‌بادی‌ها و مسیرهای بیوشیمیایی به کار می‌رود. همچنین بسیاری از تست‌های تشخیصی در آزمایشگاه‌های میکروب‌شناسی بر پایه کشت باکتری و تحلیل کلونی‌های حاصل از نمونه‌ها انجام می‌شود. انتخاب فلاسک یا پلیت مناسب برای کشت سلول به منظور دستیابی به تعداد مطلوب سلول و حداقل میزان آلودگی بسیار حائز اهمیت است.
انواع فلاسک‌های کشت سلول
فلاسک‌های کشت سلول را می‌توان بر اساس نوع سلول (باکتری، جانوری، گیاهی)، هدف کشت، تعداد سلول‌های مورد نیاز، نوع محیط کشت و چسبندگی یا معلق بودن سلول‌ها دسته‌بندی کرد. انواع متداول این فلاسک‌ها شامل فلاسک‌های مسطح، اسپینر و ارلن مایر هستند که در اندازه‌های مختلف تولید می‌شوند. سطح داخلی این فلاسک‌ها بسته به نیاز، با مولکول‌های زیستی (مانند کلاژن) یا شیمیایی پوشیده می‌شود.
فلاسک‌های مسطح
فلاسک‌های مسطح از رایج‌ترین انواع ظرف‌های کشت سلول‌های جانوری هستند. طراحی این فلاسک‌ها شامل یک گردن است که انتقال محیط کشت را آسان می‌کند. این فلاسک‌ها به شکل حرف T انگلیسی بوده و به انواع T25، T75، T175، T225 و T300 تقسیم می‌شوند که این تقسیم‌بندی بر اساس مساحت سطح موجود برای کشت سلول‌ها است. به عنوان مثال، مساحت فلاسک T25، ۲۵ سانتی‌متر مربع است. تعداد سلول‌های قابل کشت در هر یک از این فلاسک‌ها متفاوت است، برای مثال:
– فلاسک T25: حدود ۲،۸۰۰،۰۰۰ سلول
– فلاسک T75: حدود ۸،۴۰۰،۰۰۰ سلول
– فلاسک T175: حدود ۲۳،۳۰۰،۰۰۰ سلول
– فلاسک T225: حدود ۳۰۰،۰۰۰،۰۰۰ سلول
فلاسک‌های چند لایه
فلاسک‌های چند لایه به دو نوع مسطح و دایره‌ای تقسیم می‌شوند. این فلاسک‌ها دارای چندین بخش مختلف هستند که مساحت سطح قابل استفاده برای کشت سلول را افزایش می‌دهند. به عنوان مثال، یک فلاسک ۵ لایه می‌تواند با استفاده از ۱۰ میلی‌لیتر محیط کشت در هر سطح، تعداد سلول‌های بیشتری را در همان حجم فلاسک تک‌لایه کشت دهد.
اسپینر
فلاسک‌های اسپینر بخشی از سیستم‌های بیوراکتوری هستند که برای کشت سلول‌ها در محیط مایع استفاده می‌شوند. این فلاسک‌ها معمولاً استوانه‌ای شکل بوده و از جنس شیشه یا پلیمرهای خنثی ساخته می‌شوند. فلاسک‌های اسپینر بیشتر در کشت سلول‌های صنعتی استفاده می‌شوند و ظرفیت آن‌ها بین ۱۰۰ تا ۱۰۰۰ میلی‌لیتر است.
فلاسک‌های کشت سلول با دیواره متحرک
فلاسک‌های با دیواره متحرک برای خارج کردن سلول‌های بنیادی، استخوانی و بافت‌ها طراحی شده‌اند. این فلاسک‌ها شبیه فلاسک‌های مسطح هستند، اما یکی از دیواره‌های آن‌ها قابل جدا شدن است که دسترسی راحت به سلول‌های کشت شده را ممکن می‌سازد. این فلاسک‌ها در کشت بافت و داربست‌های سلولی کاربرد فراوانی دارند.
فلاسک‌های کشت سلولی اتوماتیک
در کشت سلولی اتوماتیک، بخشی یا تمام فرایندهای کشت به‌وسیله دستگاه‌های برنامه‌ریزی شده انجام می‌شود. فلاسک‌های این روش معمولاً مستطیلی و با قطر کمتری نسبت به فلاسک‌های مسطح هستند و برای کار با دستگاه‌های اتوماتیک طراحی شده‌اند.
پتری‌دیش
پتری‌دیش‌ها برای کشت سلول‌های باکتریایی استفاده می‌شوند و معمولاً از شیشه یا پلیمرهای خنثی ساخته می‌شوند. این ظروف دایره‌ای شکل می‌توانند در انکوباتورهای کشت سلولی قرار گیرند و برای محیط‌های کشت جامد مناسب هستند. لوله‌های آزمایش نیز یکی از ابزارهای پرکاربرد در آزمایشگاه‌های زیست و شیمی هستند و برای کشت‌های مایع و نیمه‌جامد باکتری به کار می‌روند.
انواع پوشش سر فلاسک کشت سلول
در فلاسک‌های کشت سلولی، دو نوع پوشش سر یا کَپ وجود دارد: کَپ مهروموم بدون منفذ و کَپ منفذدار. کَپ مهروموم بدون منفذ برای روش‌هایی استفاده می‌شود که محیط کشت باید کاملاً از محیط اطراف جدا باشد. کَپ منفذدار دارای فیلتری با قطر ۲ میکرومتر است که اجازه می‌دهد اکسیژن وارد محیط کشت شود، در حالی که از ورود آلودگی‌های محیطی جلوگیری می‌کند. این نوع کَپ برای سلول‌هایی مناسب است که به اکسیژن بیشتری نیاز دارند.
انتخاب فلاسک مناسب برای کشت سلول
در پروژه‌های تحقیقاتی که از سلول‌های رده پستانداران استفاده می‌شود، اولین مرحله جدا کردن سلول و آماده‌سازی نمونه جانوری است. روش‌های آماده‌سازی بسته به نوع سلول متفاوت هستند. به عنوان مثال، سلول‌های خونی به راحتی از خون جدا می‌شوند، در حالی که سلول‌های استخوانی نیاز به آنزیم‌های هیدرولازی (مانند کلاژناز، تریپسین و پروناز) برای تجزیه ماتریکس بافت و جداسازی دارند.
سلول‌های خونی که به اتصال به سطح نیاز ندارند، می‌توانند در محیط‌های کشت مایع و فلاسک‌های بدون پوشش دیواره کشت شوند. اما سلول‌های بافت‌های نرم و سخت مانند استخوان، نیاز به سطحی مشخص (معمولاً پوشیده شده از کلاژن‌ها و لامین‌های ماتریکس خارج سلولی) برای تکثیر و رشد دارند. به این سلول‌ها، سلول‌های معلق و سلول‌های چسبنده گفته می‌شود.
فلاسک‌های پوشش‌دار با پلی-L-لیزین و کلاژن نوع I برای سلول‌های چسبنده بسیار مناسب هستند، به ویژه برای سلول‌های اولیه که اتصال خوبی به ماتریکس‌های دیگر ندارند یا رشد آن‌ها کند است. این فلاسک‌ها محیط مناسبی برای اتصال، رشد و تمایز سلول‌های چسبنده فراهم می‌کنند.
آماده‌سازی فلاسک کشت سلول
پس از انتخاب فلاسک مناسب بر اساس نوع سلول و محیط کشت، برای جلوگیری از آلودگی، محیط کشت استریل را با استفاده از پیپت استریل و در زیر هود لامینار به فلاسک اضافه کنید. مقدار محیط کشت باید به اندازه‌ای باشد که ۰٫۲ تا ۰٫۵ سانتی‌متر از ارتفاع فلاسک را پر کند.
تغییر فلاسک کشت و شمارش سلول‌ها
سلول‌های اولیه پس از چند هفته تکثیر، سطح فلاسک را پر می‌کنند و نیاز به مواد غذایی بیشتری دارند. در این مرحله، ممکن است سلول‌ها تغییر شکل دهند یا دچار آپوپتوز شوند. برای جلوگیری از این وضعیت، باید سلول‌ها را به فلاسک دیگری منتقل کنید، که به این فرایند پاساژ سلول گفته می‌شود.
برای بررسی تراکم سلول‌های چسبنده، فلاسک را در بازه‌های زمانی مشخص زیر میکروسکوپ فاز معکوس بررسی کنید. همچنین می‌توانید pH محیط کشت را برای ارزیابی غلظت مواد غذایی اندازه‌گیری کنید. کاهش pH محیط نشان‌دهنده افزایش لاکتیک‌اسید و کمبود گلوکز است. اگر pH محیط کشت بیش از ۰٫۱ تا ۰٫۲ واحد تغییر کرد، بهتر است محیط کشت را با محیط کشت تازه تعویض کنید.
منحنی رشد سلولی
رشد سلول در محیط کشت از سه مرحله کند (lag)، رشد سریع (log) و توقف رشد تشکیل شده است. انتهای مرحله لگاریتمی بهترین زمان برای تعویض محیط و فلاسک کشت سلول است. در این مرحله، سلول‌ها به حداکثر سرعت رشد خود رسیده‌اند و نیاز به مواد مغذی و فضای بیشتری دارند.
تعویض فلاسک و محیط کشت
برای تعویض فلاسک و محیط کشت، سلول‌های چسبنده را می‌توان با روش‌های فیزیکی یا آنزیمی از سطح فلاسک جدا کرد.
روش‌های فیزیکی
این روش‌ها برای رده‌های سلولی با اتصال ضعیف به سطح مناسب هستند. با تکان دادن آهسته فلاسک یا پیپت کردن سریع محیط کشت، سلول‌ها را می‌توان به‌راحتی از کف فلاسک جدا کرد. همچنین می‌توان از اسکراپرهای مخصوص کشت سلولی برای جدا کردن سلول‌ها استفاده کرد. اما باید دقت کرد که سلول‌های حساس ممکن است در این روش آسیب ببینند.
روش‌های آنزیمی
تریپسین، کلاژناز و دیسپاز سه پروتئاز پرکاربرد هستند که برای جدا کردن سلول‌های چسبنده از سطح فلاسک کشت استفاده می‌شوند. ترکیب تریپسین و کلاژناز برای جدا کردن سلول‌های بسیار متراکم و چندلایه مانند فیبروبلاست‌ها استفاده می‌شود. دیسپاز نیز برای جدا کردن کامل سلول‌های اپیدرمی بدون آسیب به یکپارچگی صفحه سلولی به کار می‌رود.
شمارش سلول‌های کشت شده
شمارش سلول‌های کشت شده یکی از روش‌های ارزیابی سلامت سلول‌ها، اطمینان از صحت مراحل کشت و تعیین زمان تعویض فلاسک است. تعداد سلول‌های موجود در فلاسک را می‌توان با استفاده از لام هموسیتومتر یا دستگاه‌های سلول‌شمار اندازه‌گیری کرد. در بسیاری از آزمایشگاه‌های تحقیقاتی، از لام‌های هموسیتومتر و رنگ متیلن بلو برای شمارش سلول‌های معلق و چسبیده استفاده می‌شود.
شمارش سلول‌های معلق
برای شمارش سلول‌های معلق نیازی به جداسازی سلول نیست. با استفاده از پیپت، حجم مشخصی از سلول‌ها و محیط کشت را روی لام هموسیتومتر قرار دهید. قبل از برداشت سلول‌ها، فلاسک کشت را تکان دهید تا نمونه یک‌نواخت شود.
شمارش سلول‌های چسبنده
برای شمارش سلول‌های چسبنده ابتدا باید سلول‌ها را با تریپسین از سطح فلاسک جدا کنید. مراحل زیر را دنبال کنید:
- محیط کشت را با پیپت از فلاسک خارج کنید.
- سلول‌ها را با محلول بافر فسفات شست‌وشو دهید.
- تریپسین همراه با EDTA را به محیط اضافه کرده و چند دقیقه انکوبه کنید.
- تریپسین را از محیط خارج کنید و سلول‌ها را با بافر فسفات شست‌وشو دهید.
- با اضافه کردن محیط کشت، سلول‌ها را دوباره معلق و سانتریفیوژ کنید.
- رسوب ته‌نشین‌شده را با همان حجم اولیه محیط کشت معلق کنید.
- مقداری از محلول سلول‌ها را پس از مخلوط کردن با تریپان بلو روی لام هموسیتومتر استریل بریزید.
شمارش سلول‌ها با لام هموسیتومتر
لام هموسیتومتر را زیر میکروسکوپ قرار دهید و تعداد سلول‌ها در چهار مربع اصلی را بشمارید (سلول‌های داخل مربع، ضلع راست و ضلع پایینی). برای محاسبه کل سلول‌ها، میانگین سلول‌های شمارش‌شده را در حجم اولیه و میزان رقیق‌سازی ضرب کنید. این روش به شما کمک می‌کند تا سلامت و تعداد سلول‌ها را به دقت ارزیابی کنید و در زمان مناسب محیط کشت و فلاسک را تعویض کنید.
با راشا زیست همرا باشید…
